Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist ein Analyseverfahren, das zur Identifizierung der Bestandteile eines Gemischs und zur Trennung von Gemischen sehr ähnlicher Verbindungen eingesetzt wird.

Was ist HPLC?

Mit Hilfe der HPLC lassen sich die Bestandteile einer Verbindung trennen. Es lässt sich feststellen, wieviel von jeder Verbindung in dem Gemisch enthalten ist und um welche Verbindung es sich handelt. Die HPLC ist die Technik der Wahl, wenn es darum geht, Materialien auf eine Vielzahl organischer Verbindungen zu analysieren. Flüchtige Verbindungen (VOC und SVOC) werden in der Regel am besten mit GC oder GC-MS analysiert, aber HPLC ist für eine viel größere Vielfalt von Gemischen geeignet, einschließlich nicht flüchtiger oder thermisch instabiler Moleküle. Zu ihren Vorteilen gehören Vielseitigkeit, Empfindlichkeit und die Anwendbarkeit auf sehr komplexe Gemische.

 

Wie funktioniert die HPLC?

Die Trennung mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie beruht auf der Affinität der verschiedenen Verbindungen des Analyten zur mobilen Phase (Eluent) und zur stationären Phase. Die spezifischen intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den Molekülen eines Bestandteils der Probe und dem Packungsmaterial führen dazu, dass diese Moleküle transitorisch auf die stationäre Phase aufgenommen werden. 

Je größer die Wechselwirkung mit der stationären Phase im Vergleich zur mobilen Phase ist, desto länger dauert die Wechselwirkung. Dadurch steigt wiederum die Verweildauer auf der Säule und die Retentionszeit (Rf) für diese Komponente. Die Leistungsfähigkeit der Technik ergibt sich aus der breiten Palette an mobilen und stationären Phasen, die zur Feinabstimmung der Trennungen verwendet werden können.

 

Was sind die verschiedenen Anwendungsbereiche der HPLC?

Die HPLC ist ein weit verbreitetes und äußerst leistungsfähiges chromatographisches Verfahren, das unter anderem in pharmazeutischen, bioanalytischen, Lebensmittel- und Getränke-, klinischen, forensischen, Umwelt- und Arzneimittelentwicklungslaborens eingesetzt wird. 

Im medizinischen Bereich kann die HPLC beispielsweise zur Bestimmung der Inhaltsstoffe und Konzentrationen von Substanzen in biologischen Materialien eingesetzt werden. Dazu gehört beispielsweise die Analyse von Drogen im Urin oder der Nachweis von Vitaminen im Blutserum.

 

Welche verschiedenen HPLC-Typen gibt es?

Normalphasen-HPLC

Bei der Normalphasenchromatographie ist die stationäre Phase unpolar und die mobile Phase ist polar. Das bedeutet, dass alle unpolaren Substanzen in der Probe schneller eluiert werden, da sie der mobilen Phase ähnlicher sind und sich schnell bewegen. 

Reversed Phase / Umkehrphase

Die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist das Gegenteil der Normalphase. Dabei wird eine polare mobile Phase, z.B. Wasser und ein polares organisches Lösungsmittel, mit einer unpolaren, hydrophoben stationären Phase verwendet.

Die Umkehrphasen-HPLC wird häufig der Normalphasen-HPLC vorgezogen, da durch die Verwendung von Wasser als Lösungsmittel die Gefahr einer Verzerrung der Retentionszeiten der Analyten aufgrund der Absorption von Wasser in der Atmosphäre ausgeschlossen wird. Die Reversed Phase-HPLC gilt auch als flexibler, da die hydrophobe stationäre Phase in Verbindung mit hydrophoben, hydrophilen, ionischen und ionisierbaren Verbindungen verwendet werden kann, um deren verschiedene Verbindungen zu trennen.

Isokratische Elution vs. Gradientenelution

Isokratische Elution bedeutet, dass ein konstanter Gradient in der mobilen Phase aufrechterhalten wird. Die Gradientenelution bezieht sich dagegen auf einen Versuch, bei dem die Konzentration der mobilen Phase variiert.

Die Gradientenelution hat gegenüber der isokratischen Elution mehrere Vorteile, da sie für einen gleichmäßigeren Abstand von Peaks mit ähnlicher Breite im gesamten resultierenden Chromatogramm sorgt. Bei der isokratischen Elution haben die Peaks oft eine geringere Auflösung und liegen zu Beginn des Prozesses sehr dicht beieinander, während sie zum Ende hin viel breiter werden. Die Gradientenelution kann auch eine noch kürzere Laufzeit bieten. 

Allerdings wird die isokratische Elution häufig der Gradientenelution vorgezogen, da der Gradientenprozess mehr Sorgfalt und Kontrolle seitens des Bedieners erfordert. Außerdem erfordert die isokratische Elution eine weniger spezialisierte chromatographische Ausrüstung.

 

Instrumente

Pumpen:

Handelt es sich bei der HPLC um ein Gradientensystem, wird entweder ein Niederdruckgradienten- (LPG) oder ein Hochdruckgradienten-Verfahren (HPG) genutzt. Bei HPG werden die Lösungsmittel auf der Auslassseite gemischt und von einzelnen Pumpen zugeführt. Beim LPG-Verfahren werden die Lösungsmittel dagegen auf der Saugseite gemischt.

Säule:

Die Säule ist das Herzstück eines jeden HPLC-Systems, da sie für die Trennung der Probenverbindungen verantwortlich ist. Je nach den Anforderungen Ihres Experiments stehen verschiedene HPLC-Säulen zur Verfügung. So kann die Säule beispielsweise mit einer Vielzahl unterschiedlicher Packungsmaterialien gefüllt werden, um die verschiedenen HPLC-Typen, wie Umkehrphase oder Normalphase, zu unterstützen.

Detektor:

Der Detektor misst die Zeit und die Menge jeder Substanz, die von der Säule eluiert wird. Im Verlauf des Verfahrens registriert der Detektor den Unterschied in der Zusammensetzung und setzt ihn in ein elektrisches Signal um, aus dem ein Chromatogramm erstellt wird.

 

Chromatographische Parameter

Während des chromatographischen Prozesses erzeugt der Detektor elektronische Signale, die von einem begleitenden Computer in ein Chromatogramm umgewandelt werden können. Anhand dieser Diagramme lassen sich die in der Probe vorhandenen Substanzen und deren Mengen bestimmen. Jeder Signalpeak steht für einen Analyten, der von einer mobilen Phase durch die Säule transportiert wurde.

Aus diesen Peaks lässt sich eine Vielzahl von qualitativen Informationen gewinnen, vom Zeitpunkt des Peaks bis zur Konzentration der Substanz (dargestellt durch die Fläche unter dem Diagramm). Es ist auch wichtig, die Auflösung des Prozesses zu berücksichtigen. Ein Auflösungswert von 1,5 oder mehr zwischen zwei Peaks bedeutet, dass die Probenbestandteile so weit voneinander getrennt sind, dass die Höhe und Breite der Peaks genau gemessen werden können. 

Die Auflösung kann mit Hilfe der Fundamental-Resolution-Gleichung berechnet werden. Diese Gleichung berücksichtigt die HPLC-Parameter Effizienzfaktor (N), Retentionsfaktor (kappa prime) und Trennfaktor (alpha). Durch Anpassungen können diese Parameter geändert und die Auflösung des Experiments verbessert werden, z.B. durch die Änderung des im Experiment verwendeten Lösungsmittels oder die Änderung der Temperatur.

Der Einfluss von Wasser

Wie wirkt sich Reinstwasser auf die HPLC aus?

Die HPLC ist in hohem Maße von der Reinheit des Wassers abhängig. Die Verwendung einer unzureichenden Wasserqualität zur Herstellung von Eluenten, Blindwerten, Proben und Standards könnte Verunreinigungen in das Experiment einbringen und die chromatographische Leistung durch Beeinträchtigung von Auflösung, Integration und Basislinien verschlechtern. Wasser ist das am häufigsten verwendete Reagenz in der HPLC. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass das gewählte Wasser die für die Empfindlichkeit der jeweiligen Anwendung erforderliche Reinheit aufweist.

 

Welchen Wassertyp sollten Sie verwenden?

Für HPLC-Experimente mit allgemeiner Empfindlichkeit empfehlen wir Reinwasser des Typs II+. Ist die Empfindlichkeit der Anwendung jedoch hoch, sollte ultrareines Typ I+ Reinstwasser verwendet werden mit einem spezifischen Widerstand von mehr als 18 MΩ*cm, einem TOC-Wert von weniger als 2 ppb, einem Bakteriengehalt von weniger als 1 KBE/ml und weniger als 0,03 EU/ml (Endotoxinen).

 

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